細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本FISH玻片處理4.0

試劑準(zhǔn)備：（mm2.1:H2O:cot-1=7：2：1）

   1、蛋白酶K  25ml

    A、 10%SDS            120ul     96        86.4

    B、 蛋白酶K   20mg/ml     250ul     200        180

    C、 PBS       補(bǔ)齊至    25ml      20ml       18ml

2、PBS：PH7.0      3、二甲苯        4、100% 、 85%  、75% 的酒精     

5、甲醇：乙酸=3：1

6、變性液 ： 35ml 甲酰胺， 5ml  20*SSC (PH=7.0),  10ul  0.5M EDTA  pH=7.0， 10ml 單蒸水，最后50ml pH=7.0-7.5     4℃保存，1個(gè)月使用有效。

7、20*SSC                   8、洗液：2*SSC  含 0.1% 吐溫-20   9、秋水酰素：10ug/ml

     9、甲醇：乙酸=3：1

預(yù)處理：

1.   培養(yǎng)細(xì)胞長到融合率70%-90%時(shí)候，加入25ul秋堿/5ml培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘到2小時(shí)（依據(jù)細(xì)胞生長率不同和細(xì)胞系特性，調(diào)整時(shí)間）。

2.   胰酶消化細(xì)胞。

3.   預(yù)熱 0.075 KCl 在37ºC 水浴箱。

4.   5ml預(yù)熱的0.075M KCl,大力吹打。37℃孵育10-30分鐘。;

5.   預(yù)固定：加2ml固定液，輕輕吹打。固定10分鐘。離心1000rpm，10分鐘。丟棄上清，再同樣5ml固定，離心2次。

6.   去掉上清，留下上清液的量使得細(xì)胞保持在牛奶狀細(xì)胞團(tuán)，一般是0.5-1mL .如果滴片，請(qǐng)立即滴片。在適當(dāng)高度滴片（10-30cm）。如果不用，不去除最后一次上清。1-2天用放2-8℃，如果長時(shí)間不用冷凍起來。

7.   老化：染色體片子，37℃老化1-7天。用前60攝氏度，加熱3-4小時(shí)。

8.   變性液：74℃±1水浴平衡至少30分鐘或用雜交儀。（注意溫度：容器內(nèi)和實(shí)際溫度），將玻片浸入2-5分鐘，依據(jù)玻片的制備時(shí)間每增加一周，時(shí)間增加2分鐘。

9.   梯度脫水：馬上置入冰冷70%酒精3分鐘，然后85%、100%酒精脫水，各1分鐘。用前放置到37-45攝氏度備用。

 

探針變性：

1、77℃變性5分鐘，37℃平衡2分鐘，建議用PCR儀。

2、將探針加在完全干燥的玻片上。（注意避光）

3、加蓋玻片，Rubber 膠封片。過夜（12-18小時(shí)）。

 

玻片洗滌：

1，   準(zhǔn)備2缸洗液。1缸置于72℃，至少30分鐘。

2，   輕輕揭去玻片上的膠，如果不好揭開以及為避免干燥，可以先放在常溫洗液里面。

3，   72℃缸，洗滌2分鐘；常溫缸，洗滌2分鐘。

4，   脫水，75%、85%、100%酒精，1分鐘。空氣干燥。  

觀察結(jié)果：

1、  加DAPI 20ul復(fù)染，加蓋玻片。

2、  置于暗處20分鐘，顯微鏡觀察結(jié)果。

3、結(jié)果，鏡下觀察需要考慮濾光片和顯微鏡調(diào)節(jié)，請(qǐng)仔細(xì)觀察。（有些熒光眼睛看不到，需借助顯微鏡）

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