納米金顆粒標(biāo)記核酸探針特異性檢測細(xì)菌的實習(xí)報告
學(xué)生姓名:王瑞晨 學(xué)校:齊魯理工學(xué)院 實習(xí)單位:外顯子生物實驗室
報告日期：2024年8月1日至8月30日
1. 實驗?zāi)康?span>
利用金納米顆粒標(biāo)記寡核苷酸探針特異性檢測細(xì)菌。
2. 研究背景
2.1 納米金顆粒的特性
金（Au）是一種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且被廣泛認(rèn)知的貴金屬，具備良好的導(dǎo)電性能和導(dǎo)熱性能。金在納米級別時展現(xiàn)出獨特的光學(xué)特性，這些特性主要包括其表面等離子體共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）效應(yīng)[1]。獨特的光學(xué)特性指的是金納米顆粒在特定波長的光照射下表現(xiàn)出的特殊光學(xué)行為，這些行為與其形狀、尺寸大小和周圍環(huán)境的光學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)[2]。此外，表面等離子體共振效應(yīng)是指金納米顆粒表面的自由電子在與光場相互作用時發(fā)生的集體振蕩，形成強烈的光吸收和散射現(xiàn)象。等離子體共振是由于金屬納米顆粒的電子云在光的作用下發(fā)生共振，導(dǎo)致其對特定波長光的吸收和散射顯著增強，其在提高檢測靈敏度上有顯著的提升[3]。
金納米顆粒的光學(xué)特征，如顯著的光散射、極化激元模式等[4]，這些顯著的光學(xué)特性讓其在生物成像和傳感器領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用[5]。其中，光散射指的是光線被金納米顆粒偏轉(zhuǎn)或反射的現(xiàn)象，而光吸收則是指光線的能量被顆粒吸收并轉(zhuǎn)化為其他形式的能量。這些特性使金納米顆粒在探測和成像中極具優(yōu)勢。
此外 ，金的化學(xué)穩(wěn)定性及生物相容性使其在生物標(biāo)記和診斷中十分出色[6、7、8]。同時，金納米顆粒可以形成穩(wěn)定的金屬鍵，這對于顆粒的功能化是至關(guān)重要的[9、10、11]，金還可以與特定的核酸序列結(jié)合，如AAAA等序列。顆粒的功能化包括對金納米顆粒進行化學(xué)修飾，以實現(xiàn)特定的生物標(biāo)記功能。金納米顆粒的大小和形狀對其功能化的效果有顯著影響。如球形金納米顆粒通常具有均勻的光學(xué)特性，適用于廣泛的生物成像應(yīng)用，而納米棒狀或納米星狀顆粒則可以通過調(diào)整其尺寸和形狀實現(xiàn)對不同波長光的特異性響應(yīng)。這些特征使得金納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用更加精準(zhǔn)和多樣化。
2.2 核酸的特性
核酸是由核苷酸單元構(gòu)成的長鏈聚合物，分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。DNA通常呈雙鏈結(jié)構(gòu)，氫鍵穩(wěn)定其雙螺旋構(gòu)型，而RNA則通常為單鏈，在某些區(qū)域可能形成局部的二級結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)）。核酸在生命過程中發(fā)揮核心作用，負(fù)責(zé)攜帶遺傳信息并參與基因表達調(diào)控。核酸分子由于其磷酸骨架中的磷酸根離子(PO43-)而帶有負(fù)電荷。這一特性賦予核酸獨特的溶解性，并使其可與其他帶正電的分子發(fā)生相互作用。相較于單鏈DNA，雙鏈DNA具有更高的穩(wěn)定性，而RNA的結(jié)構(gòu)則展現(xiàn)出更大的靈活性，使其能夠承擔(dān)多樣的生物功能。核酸的來源可以使提取DNA或PCR產(chǎn)物或合成的寡核苷酸。
2.3 金與核酸的結(jié)合
金納米顆粒與核酸的結(jié)合可以通過多種方式實現(xiàn)。最常用的方法是通過金顆粒表面與核酸中的巰基修飾寡核苷酸結(jié)合。這些巰基化合物（如硫醇）與金之間存在著強烈的化學(xué)親和力，能夠在金顆粒表面形成穩(wěn)定的自組裝單層（Self-Assembled Monolayers, SAMs）。除了巰基外，其他化合物，如胺基（-NH2）[12]、磷酸基團（-PO4）[13]、雙硫鍵（-S-S-）[14]和聚乙二醇（PEG）[15]等，也可用于與金納米顆粒結(jié)合。通過這些化學(xué)修飾，目標(biāo)核酸可以有效地固定在金納米顆粒的表面，從而實現(xiàn)金納米顆粒與核酸的高效連接。
2.4 金納米標(biāo)記的核酸探針的應(yīng)用
考慮金納米標(biāo)記核酸探針的獨特光學(xué)和生物學(xué)特性，其在生物傳感、疾病診斷等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。這些探針可以被用來標(biāo)記特定的細(xì)胞或微生物，以研究其在生物體內(nèi)的分布情況。例如，在細(xì)菌標(biāo)記方面，金納米標(biāo)記的核酸探針能夠特異性識別細(xì)菌表面的特定核酸序列，這有助于科研人員追蹤細(xì)菌在組織中的位置。此外，這些探針還能夠用于檢測環(huán)境樣本中的病原微生物，提升檢測的靈敏度和特異性。但是，金納米標(biāo)記的核酸探針在應(yīng)用中仍然具有一些不足之處。首先是靈敏度的限制，金納米標(biāo)記的核酸探針在檢測低濃度時，往往會因為受背景信號的干擾導(dǎo)致檢測不準(zhǔn)確[16]。另外長期使用金納米顆粒標(biāo)記的核酸探針也可能帶來生物安全的問題。研究者做的關(guān)于表面電荷對聚乙二醇修飾金納米離子生物行為的影響中也提到了PEG修飾的AuNPs具有較低的生物毒性[17]。這意味著金納米顆粒與核酸的結(jié)合應(yīng)用越來越多，然而需要標(biāo)記出較好金核酸并非容易，需要優(yōu)化各種條件，才能獲得好的實驗結(jié)果，發(fā)揮診斷應(yīng)用、傳感技術(shù)的應(yīng)用。
3. 實驗原理
本實驗利用金納米顆粒的光學(xué)特性及金納米標(biāo)記核酸探針對大腸桿菌DNA序列的特異性識別。首先，將巰基修飾核酸與金納米顆粒結(jié)合，然后利用該探針標(biāo)記大腸桿菌，進而觀察其分布。在電子顯微鏡觀察下，由于金納米探針具有高電子密度，會產(chǎn)生明顯的亮點，這為我們直接記錄大腸桿菌上金納米探針的分布及數(shù)量提供了基礎(chǔ)。
4. 材料和方法
4.1 材料與試劑
氯化金水溶液（1 mM），檸檬酸三鈉溶液（0.921M），細(xì)菌16S納米金SH探針 NNNNNNNN，EUB338納米金SH探針。，ddH2O（用于重新懸浮金納米顆粒）
大腸桿菌EUB338：5’-GCTGCCTCCCGTAGG-3’.PBS緩沖液
4.2 實驗步驟
4.2.1 制備金納米顆粒
配制1mM濃度的氯化金水溶液，將氯化金溶液加熱至沸騰。迅速加入適量的還原劑（檸檬酸三鈉溶液，0.921M），并繼續(xù)加熱攪拌。待溶液顏色變?yōu)樯罴t色后，停止加熱并自然冷卻至室溫。
4.2.2 硫醇修飾核酸探針的結(jié)合
核酸探針溶液的制備：先將核酸探針以1000轉(zhuǎn)離心1min，然后在細(xì)菌16S SH核酸探針加入100µL的ddH2O，在EUB338納米金SH加入122µL，配置成100µM。分別將20µL硫醇修飾的核酸探針溶液加入到含有400µL的金納米顆粒溶液的玻璃試管中。在微波爐中以中低火加熱3min，加熱后溶液出現(xiàn)粉紅色。確保核酸探針充分結(jié)合到金納米顆粒表面�；謴�(fù)室溫后，將溶液轉(zhuǎn)入離心管中，在15℃、12000轉(zhuǎn)、離心20min。通過離心分離未結(jié)合的核酸探針。離心完后觀察到底部出現(xiàn)紅色沉淀，去除上清，在沉淀中加入200µLddH2O重新懸浮金納米顆粒。
4.2.3 探針與大腸桿菌的結(jié)合
1.將大腸桿菌重懸于適量的生理鹽水或PBS緩沖液中。
2.采用消化法、鹽酸處理方、打孔的方法增加細(xì)胞膜的滲透性。
3.將處理好的大腸桿菌與金納米顆粒標(biāo)記的核酸探針混合均勻。
4.在37°C孵育一段時間（60分鐘），促進探針與細(xì)菌的結(jié)合。
4.2.4 觀察與檢測
使用奧林巴斯顯微鏡，最好是電子顯微鏡觀察標(biāo)記的金納米顆粒的細(xì)菌，但是是否結(jié)合到大腸桿菌上需要用電子顯微鏡觀察。
5實驗結(jié)果
5.1氯化金（AuCI3）溶液的制備
實驗中我們使用1g的氯化金（如下圖1所示）配置成1.43mol/L的氯化金溶液（如下圖1所示）制備中氯化金固體顆粒呈現(xiàn)黃色透明小顆粒，制備完后的氯化金溶液呈現(xiàn)淡黃色。
圖1
5.2膠體金溶液制備前的準(zhǔn)備
5.2.1 1mM氯化金溶液的制備
通過吸取70µ L的氯化金溶液（濃度為1.43mol/L）加入到塑料瓶中，而后在量取336ml的蒸餾水，加入到塑料瓶中，攪拌混合成1mM的氯化金溶液。
5.2.2 檸檬酸三鈉溶液的制備
稱取23.5g的檸檬酸鈉，倒入到塑料瓶中，并加入100mL蒸餾水，搖勻，配置成0.921M的檸檬酸三鈉溶液（如下圖2所示）。[18]
圖2
5.3膠體金溶液的制備
將裝有氯化金的塑料瓶進行水浴加熱，水開后加熱5分鐘后迅速加入檸檬酸三鈉溶液，并持續(xù)用玻璃棒進行攪拌，待溶液呈現(xiàn)深紅色（如下圖3所示）后停止攪拌，并冷卻至室溫。
圖3
5.3 膠體金與核酸探針混合以后的圖像
5.3.1膠體金溶液與核酸探針混合離心以后如下圖所示
（上圖為第一次膠體金與核酸探針混合離心完后的圖像，其中左圖為EUB338納米金SH探針與膠體金溶液結(jié)合離心后的圖像，右圖為細(xì)菌16S納米金SH探針與膠體金溶液結(jié)合離心后的圖像）
（上圖為第二次膠體金與核酸探針混合離心完后的圖像，其中左圖為EUB338納米金SH探針與膠體金溶液結(jié)合離心后的圖像，右圖為細(xì)菌16S納米金SH探針與膠體金溶液結(jié)合離心后的圖像）
（上圖為第三次膠體金與核酸探針混合離心完后的圖像，其中左邊離心管為EUB338納米金SH探針與膠體金溶液結(jié)合離心后的圖像，右邊離心管為細(xì)菌16S納米金SH探針與膠體金溶液結(jié)合離心后的圖像）
5.3.2實驗顯示三次獨立的重復(fù)實驗，實驗結(jié)果基本一致
在本實驗中，為了驗證金納米顆粒與核酸探針結(jié)合成功的可靠性，我們對關(guān)鍵實驗步驟即核酸探針與納米金顆粒的結(jié)合，進行了三次獨立重復(fù)實驗。實驗結(jié)果如下表格所示，兩次實驗均使用了相同的樣本、試劑和實驗條件。實驗結(jié)果表明，在三次獨立重復(fù)實驗中，觀察到基本一致的結(jié)果。
實驗結(jié)果
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編號 |
內(nèi)容物 |
結(jié)果（實驗一） |
結(jié)果（實驗二） |
結(jié)果（實驗三） |
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1 |
超純水2.5µ L |
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2 |
細(xì)菌16S納米金SH探針與膠體金溶液微波加熱離心完后上清液2.5µ L |
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3 |
細(xì)菌16S納米金SH探針與膠體金溶液微波加熱離心完后沉淀2.5µ L |
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4 |
EUB338納米金SH探針與膠體金溶液微波加熱離心完后上清液2.5µL |
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5 |
EUB338納米金SH探針與膠體金溶液微波加熱離心完后沉淀2.5µ L |
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5.4膠體金溶液與氯化金溶液顏色的不同與金不同的化學(xué)狀態(tài)有關(guān)
實驗中，我們發(fā)現(xiàn)膠體金溶液呈現(xiàn)粉紅色，而氯化金溶液呈現(xiàn)黃色。這一顏色差異主要與金納米顆粒的直徑大小有關(guān)。具體來說，金納米顆粒的直徑大小直接影響其光學(xué)特性。當(dāng)金納米顆粒的直徑在10-100納米范圍內(nèi)時，它們能夠顯著吸收藍(lán)色光并散射紅色光，從而在溶液中表現(xiàn)為粉紅色[19] 。相反，氯化金溶液中的金離子直徑較小，通常不形成納米顆粒，因此在溶液中主要吸收綠色光并反射黃色光，從而呈現(xiàn)黃色 。這種顏色差異可以歸因于金納米顆粒的尺寸效應(yīng)，影響了其光的吸收和散射特性 。
6討論
6.1金納米顆粒與核酸之間的相互作用
在本實驗中，我們分析了金納米顆粒與核酸之間的相互作用。理論上，金納米顆粒與核酸之間不會發(fā)生纏繞現(xiàn)象。金納米顆粒通過化學(xué)修飾與核酸結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，該結(jié)合主要依靠金表面的巰基化合物與核酸的連接，而非纏繞。纏繞現(xiàn)象一般退化在高濃度或特定條件下的分子間相互作用，而金納米顆粒的結(jié)合則是通過穩(wěn)定的化學(xué)鍵實現(xiàn)的[20]。而在本實驗中我們借鑒了周小明課題組球形核酸探針構(gòu)建新技術(shù)[21]中通過微波爐加熱的方法，通過微波加熱促進金納米顆粒與核酸探針之間的結(jié)合，從而減少糾纏現(xiàn)象發(fā)生的可能，然而是否制備的金納米與核酸探針結(jié)合時會發(fā)生纏繞現(xiàn)象，本實驗中我們并沒設(shè)計相關(guān)實驗進行驗證，后續(xù)有待進一步實驗的驗證。
6.2金納米顆粒的形狀及大小對其在生物標(biāo)記中的應(yīng)用具有重要影響
金納米顆粒的形狀和尺寸多樣，包括球形、棒狀、星型和片狀等。其中，球形金納米顆粒被認(rèn)為是最佳選擇，因為其均勻的光學(xué)特性與穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)使其在生物探針中表現(xiàn)出良好的靈敏度和特異性。球形顆粒的表面修飾相對簡便，能夠有效與巰基修飾的核酸結(jié)合[22]，因此適合用于金納米標(biāo)記核酸探針的實驗。
6.3核酸探針是否與金成功的結(jié)合
在三次實驗中通過紫外-可見光譜圖我們并不能知道核酸探針與金是否成功的結(jié)合？而核酸探針與膠體金混合的溶液加NaOH后，OH-會破壞金與核酸探針的結(jié)合，核酸探針會剝離，而我們知道核酸在檢測中在260nm出會有波峰出現(xiàn)（如下圖4所示）。所以我們設(shè)計實驗，通過給第二次實驗中細(xì)菌16S納米金SH與膠體金溶液混合離心完后的上清液和沉淀中，分別加入NaOH。通過加入前與加入后260nm的變化來判斷金納米是否與核酸探針結(jié)合。但通過觀察圖像（如下圖5所示）我們發(fā)現(xiàn)其前后并沒有太大的變化，其進一步證明有待后續(xù)實驗的驗證。但是，膠體金與核酸探針結(jié)合，在三次測量中發(fā)現(xiàn)在離心完的上清和沉淀中都沒有核酸所特有的在260nm處的波峰，即沒有測量出核酸。所以我們有理由推測膠體金包裹住了核酸探針，因為測量時我們通過SMA4000紫外分光光度計發(fā)射特定波長的光源對代測液體進行測量，而金納米顆粒具有良好的光學(xué)性質(zhì)，所以在測量時可能反射掉了檢測的光波，導(dǎo)致在上清液和沉淀中都沒有檢測出核酸。
細(xì)菌16S納米金SH EUB338納米金SH
圖4
上清液 上清液+NaOH
沉淀 沉淀+NaOH
圖5
6.4膠體金溶液的pH是否影響金顆粒與核酸探針的結(jié)合
通過加入NaOH后發(fā)現(xiàn)前后圖像并沒有太大的變化，所以我們猜想是否是膠體金溶液的pH值影響了核酸探針與金顆粒的結(jié)合。所以我們通過滴加膠體金溶液到pH試紙，通過比色卡進行比色，發(fā)現(xiàn)其pH大概在7左右，為中性。所以可以證明并不是膠體金溶液的酸堿性對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響。
6.5膠體金顆粒直徑的大小對其紫外-可見光譜中波峰位置的影響
在前面測量其波長和pH后，我們懷疑是否是氯化金溶液不純，導(dǎo)致測量結(jié)果不能直觀反應(yīng)金顆粒與核酸探針是否成功結(jié)合。所以我們測量了高濃度的氯化金，發(fā)現(xiàn)其在290-300nm處有一個波峰（如下圖6所示）而這與周小明課題組所提到500-550nm處有波峰不一致。而通過《金納米粒子的制備及其光學(xué)性質(zhì)》的文章[23]我們知道金納米粒子直徑越大，其溶液吸收光的波長越向長波方向移動，而本實驗中我們所制備的納米金顆粒為10nm左右，而周小明課題組制備的則是30-40nm的納米金顆粒。所以這就解釋了本實驗圖像的波峰位置為什么在290-300nm處。
圖6
6.6膠體金溶液加熱后仍然保持粉紅色并沒有變?yōu)闊o色
在周小明課題組的實驗中，膠體金溶液在加熱過后溶液變?yōu)闊o色。（如下圖7A所示）而在本次實驗中，我們微波加熱了膠體金溶液，發(fā)現(xiàn)其仍然保持粉色（如下圖7B、7C所示），這可能是因為加熱時長和溫度不夠，或是與膠體金大小分布有關(guān)，進一步的研究有待后續(xù)實驗的驗證。
6.7濃的氯化金溶液有波峰而制備低濃度的膠體金溶液沒有波峰
在實驗中我們分別測量了氯化金溶液的紫外-可見光譜圖和膠體金溶液的紫外-可見光譜圖結(jié)果圖像差異明顯（如下圖8所示），我們推測這可能與溶液中離子的濃度和分散狀態(tài)有關(guān)。需進一步設(shè)計實驗進行驗證。
氯化金溶液的圖像 膠體金溶液的圖像
圖8
6.8延長微波加熱時間、加入TCEP對核酸探針與膠體金顆粒結(jié)合的影響
上述三次實驗后我們發(fā)現(xiàn)圖像始終不能很好的表達核酸探針是否與金顆粒結(jié)合，所以我們推測是不是核酸探針與金結(jié)合率不高導(dǎo)致的，可能是因為標(biāo)記有SH基團的核酸探針中SH之間發(fā)生了偶聯(lián)，影響了核酸探針與金的結(jié)合。所以我們設(shè)計了加入還原劑TCEP，實驗中我們現(xiàn)在核酸探針中加入等體積的TCEP，在38℃培育40分鐘，通過TCEP還原二硫鍵來增加核探針與金表面結(jié)合疏基的數(shù)量，然后加入膠體金溶液重復(fù)上述實驗步驟。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EUB338納米金SH上清液和細(xì)菌16S納米金SH上清液相較于不加TCEP圖像沒有明顯的變化（如下圖9所示），因此推測核酸探針與金顆粒結(jié)合在圖像中表達不明顯可能與核酸探針自身形成巰基偶聯(lián)關(guān)系不大。
TCEP+細(xì)菌16S納米金SH上清液 細(xì)菌16S納米金SH上清液
TCEP+EUB338納米金SH上清液 EUB338納米金SH上清液
圖9
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