產(chǎn)品說明
細(xì)胞核中的DNA為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)，而且很致密，通常DNA雙鏈以組蛋白為核心，盤旋而形成核小體。當(dāng)用去污劑破壞細(xì)胞膜和核膜，用高濃度鹽提取組蛋白，DNA殘留而形成類核。如果類核中的DNA有斷裂，斷裂點(diǎn)將引起DNA致密的超螺旋結(jié)構(gòu)松散，在類核外形成一個(gè)DNA暈圈。將類核置于電場中電泳，DNA斷片可從類核部位向陽極遷移，經(jīng)熒光染色后，在陽極方向可見形似彗星的特征性圖像，故稱"彗星試驗(yàn)"。彗星尾部即為遷移出類核的DNA片段。此時(shí)彗星尾部有可能還與頭部以單鏈或雙鏈的形式相連。DNA損傷越嚴(yán)重，導(dǎo)致DNA超螺旋結(jié)構(gòu)越松散，產(chǎn)生的斷裂點(diǎn)越多，DNA片段越小，從而在彗星尾部出現(xiàn)的DNA斷片越多，則慧尾的長度、面積和熒光強(qiáng)度越大。通過測量彗星尾部的長度、面積或熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，可以對DNA的損傷程度進(jìn)行定量分析。本產(chǎn)品試劑及操作經(jīng)過優(yōu)化改良，操作簡便，使用普通載玻片即可進(jìn)行，不需要使用磨砂玻片，操作過程中不易掉片；一次性制備大量樣本，做好的片子可長期保存，解決了傳統(tǒng)操作中易掉片，不易保存等問題。
試劑盒組成（略）
注意
1. 細(xì)胞裂解液、堿性電泳緩沖液，應(yīng)根據(jù)需求，現(xiàn)配現(xiàn)用。
2. PI染液應(yīng)避光低溫保存，染色時(shí)也應(yīng)在暗處進(jìn)行操作
需要自備的試劑、耗材與儀器
試劑：堿性電泳緩沖液（1mM EDTA，300mM NaOH）（現(xiàn)配現(xiàn)用）、PBS、無水乙醇； 耗材：1.5 ml 管、載玻片、22×22mm及24×24mm蓋玻片 儀器：恒溫干燥箱、微量移液器、水浴鍋、水平電泳儀 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖溶液：向裝有正常熔點(diǎn)瓊脂糖粉末的瓶中加6 ml PBS,微波爐加熱溶解，45℃水浴
鍋放置； 0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液：向裝有低熔點(diǎn)瓊脂糖粉末的瓶中加4.3ml PBS,沸水浴中加熱直至完全溶解（或微波高火30s,取出搖勻，再次高火10-30s，直至溶解），37℃水浴鍋放置。 1×中和液：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，將10×中和液與蒸餾水按1：9比例稀釋，放于4℃冰箱預(yù)冷后使用。
實(shí)驗(yàn)步驟
1、新鮮收集的細(xì)胞用冰冷的PBS洗一次，離心收集，PBS重懸使其密度為 1x106個(gè)/mL；
2、鋪膠：下述各濃度瓊脂糖凝膠均用 PBS 配制，
第 1 層凝膠的制備：取干凈的載玻片，滴加100ul 45℃預(yù)熱的0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖，加22×22mm蓋玻片，4℃放置3 min,待膠凝固后，推去蓋玻片，于60℃烘箱烤30min,直至膠完全干透，此時(shí)片子可室溫干燥條件下密封保存一周。 第 2 層凝膠的制備：取已鋪好第一層膠的玻片，將 10μL細(xì)胞（約 10 4 個(gè)）和 75μL 37℃預(yù)熱的 0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖混合均勻。迅速將含細(xì)胞的瓊脂糖滴到第1層瓊脂糖上，立即蓋上另一干凈蓋玻片（22×22mm），置 4℃ 2 min 使第2 層 LMA 凝固。 第 3 層凝膠的制備：第 2 層凝固后，在室溫下小心移去蓋玻片，滴加預(yù)熱 37℃的75μL的 0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖，如上蓋上蓋玻片(22×22mm),4℃下凝固2 min。
3、細(xì)胞裂解 移去蓋玻片，將玻片置于平皿中，倒入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液（使用前每 9mL加入 1mL 的 DMSO），4℃裂解 1~2h，取出載玻片用 PBS 漂洗。
4、DNA堿解旋 將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液，約覆過載玻片膠面 0.25cm 左右，室溫放置 20~60min,以便使DNA在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區(qū)段，使DNA斷鏈在電場中易于遷移。
5、單細(xì)胞電泳 在電壓 25V下，電泳 20-30 min。
6、中和 電泳后將載玻片置于平皿內(nèi)。加入中和緩沖液，將載玻片沒入，4℃中和三次，每次 10min，棄去 Tris-HCl 緩沖液。
7、脫水干燥 將片子浸入無水乙醇中15min，重復(fù)兩次，然后取出晾干，直至膠完全干透變薄，4℃下避光保存。
8、取出片子，滴加20 ul PI染液，蓋上蓋玻片，室溫染色10 min，顯微鏡下觀察拍照。
9、隨機(jī)選擇100個(gè)細(xì)胞，通過軟件（如CASP）測量彗星頭部直徑和尾長，根據(jù)尾長和頭部直徑比值，估計(jì)DNA的損傷程度。
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