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mRNA FISH 實(shí)驗(yàn)案例(12)-Xist 原位雜交與免疫熒光共定位
作者:Exonlab 發(fā)布于:2022/9/28 18:58:30 點(diǎn)擊量:

1. Xist探針準(zhǔn)備

1)在 Xist 序列獲得寡核苷酸探針(20-40 核苷酸長(zhǎng)度的寡核苷酸,Tm=63-65ºC,標(biāo)記多個(gè)地高辛或熒光素),探針最終濃度約為12-25μM。亦可聯(lián)系我們制備和購(gòu)買(mǎi)探針,贈(zèng)送內(nèi)參。

2)用雜交液將熒光或地高辛標(biāo)記的探針稀釋至終濃度為 250 nM 。雜交液配制:10%去離子甲酰胺,300mM NaCl30mM檸檬酸鈉;1mg/ml牛血清白蛋白;10% DSS。亦可聯(lián)系我們購(gòu)買(mǎi)。

2.制備石蠟組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞:

石蠟組織切片:詳見(jiàn)石蠟組織切片mRNA原位雜交,類似于普通免疫組化切片。培養(yǎng)細(xì)胞:移去 6 孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基。用 PBS清洗,吸出,在培養(yǎng)皿中加入 0.5ml 胰蛋白酶,孵育5-10分鐘。加入5 ml 培養(yǎng)基,打數(shù)分散細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 10ml 管中,在室溫下以 1500 rpm 離心5 分鐘。棄去培養(yǎng)基,懸浮細(xì)胞于1-2 ml PBS中,細(xì)胞備用,福爾馬林或無(wú)水乙醇固定10分鐘。用細(xì)胞對(duì)切片進(jìn)行涂片或用設(shè)備甩片,37℃晾干,過(guò)夜。

3. 免疫熒光

1)將載玻片放入裝有 PBSTT1x PBS 0.1% Tween-20,0.1% Triton-100)的染色盒或染色缸內(nèi)中10分鐘。(2) 將載玻片傾斜放置,移去液體,滴加100 μl 封閉溶液(1x PBS、1% BSA、0.1% Tween-20),覆蓋玻片,在室溫下孵育 10 分鐘。(3)取下蓋玻片,倒去封閉液,加入 40-100μl 稀釋抗體(濃度為 1:500, 熒光抗體),注意避光。蓋好蓋玻片,室溫避光孵育30分鐘。

3. 原位雜交

1)將載玻片傾斜,抗體緩沖液順玻片流下。在載玻片上加入 500 μl FISH 洗滌緩沖液(2x SSC+10% 甲酰胺),室溫孵育5分鐘。

2)傾斜玻片,去除 FISH 洗滌液,載玻片上加入20μl 寡核苷酸探針,蓋上蓋玻片,然后將載玻片轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的濕盒內(nèi);在37°C孵育 2-24 小時(shí)。

3)玻片盒內(nèi)加入 FISH 洗滌液,將洗滌液預(yù)熱(如37°C水。FISH 洗滌緩沖液。載玻片孵育5分鐘,期間,蓋玻片從載玻片上脫落。

4)更換洗滌液,將載玻片洗滌緩沖液中繼續(xù)孵育 5 分鐘。

5)將載玻片滴加 0.5 ng/ml 含抗淬滅劑DAPI溶液(我公司有售)。

6)用指甲油或甘油封片,熒光顯微鏡下觀察、拍照。4°C避光中保存幾個(gè)月。




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