堿性磷酸酶檢測試劑盒（Alkaline Phosphatase Assay Kit）

貨號：AP-T02  規(guī)格：100T    價格：310元

保存條件：4℃運(yùn)輸，-20℃保存，1年，避光。

研究背景：在科研實驗或臨床標(biāo)本檢測中，常需檢測堿性磷酸酶的含量，如細(xì)胞上清、組織裂解、肺泡盥洗液、血清、血漿、分泌物、尿液，唾液等。堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，又稱AP，標(biāo)準(zhǔn)的酶學(xué)稱堿性磷酸酯酶(EC 3.1.3.1)。該酶在堿性條件下，催化水解磷酸酯鍵。一般真核或哺乳動物的肝臟、腎臟、骨組織、胎盤中的堿性磷酸酶含量較多，該酶高溫容易失活，該酶的具體分類多。一般來說，所有干細(xì)胞的堿性磷酸酶的活性高，可以認(rèn)為干細(xì)胞誘導(dǎo)的成功的標(biāo)志。其次在腫瘤研究中，結(jié)腸癌、肝癌細(xì)胞中堿性磷酸酶的活性也會升高，人群中，兒童、部分腫瘤患者、孕婦、血清中的堿性磷酸酶活性較普通人高一些。

檢測原理：pNPP是一種常用的磷酸酶顯色底物，在堿性條件下，生成底物呈黃色，可以在400-415nm檢測吸光度。產(chǎn)物黃色越深，堿性磷酸酶檢活性與熒光數(shù)值呈線性關(guān)系，正相關(guān)。通過比色或熒光分析可計算堿性磷酸酶活性多少。

試劑盒組成：

A01：pNPP顯色液；2支， A02：DEA緩沖液 15ml； A03：2N NaOH終止液：15ml

A04：p-nitropheno標(biāo)準(zhǔn)品（10mM）：0.1ml。

使用說明：
1.準(zhǔn)備顯色底物溶液：底物溶于2.5 ml檢測緩沖液（50T），混勻，4℃放置。

2.標(biāo)準(zhǔn)品工作液：10μl pNPP溶液，加入檢測緩沖液稀釋至190ul，濃度為0.5mM。3.樣品準(zhǔn)備：細(xì)胞或組織裂解液的準(zhǔn)備：勻漿或者破碎組織，細(xì)胞直接裂解，用實驗室常用細(xì)胞裂解液或者購買我公司蛋白裂解液，樣品不要反復(fù)凍融。血漿、分泌物、血清和尿液的準(zhǔn)備：直接加樣。樣品稀釋：如樣品中含較高的堿性磷酸酶，用PBS或檢測緩沖液等進(jìn)行稀釋。

4.設(shè)置空白對照孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)品的用量分別為4、8、16、32ul，樣品通�？梢灾苯蛹�25-100ul。利用96孔板或0.2ml離心管，如下表配制：混合：配制上述體積后，利用搖床或手動輕輕混勻。

5.孵育：在37℃條件下孵育10-30分鐘。
6.終止反應(yīng)：加入100μl反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，此時呈現(xiàn)不同黃色。
7.在400-420nm范圍內(nèi)檢測吸光度。也可以用熒光檢測，最長放置4小時有效。
8.計算結(jié)果：酶的活性背景：AP活性單位定義：二乙醇胺(DEA)是應(yīng)用酶底物檢測堿性磷酸酶的首選緩沖液。DEA緩沖液具有良好的反應(yīng)動力學(xué)和更大的靈敏度。在該緩沖液25℃條件下，每分鐘水解pNPP顯色底物產(chǎn)生1微摩爾p-nitrophenol所需的堿性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位，稱一個DEA酶活力單位，計算出樣品中的堿性磷酸酶活性。

實驗須知：酶反應(yīng)時間與孵育時間相關(guān)，一般孵育30分鐘，如樣品中酶活性較高，預(yù)稀釋樣品。EDTA、鈣離子，氟離子、檸檬酸鹽，pH等對堿性磷酸酶抑制。p-nitrophenol溶液對人體有害，請小心，戴手套防護(hù)。

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