流式-原位核酸雜交（Flow-FISH）
流式技術(shù)被廣泛應用，原位雜交也是70年代的技術(shù)。兩者結(jié)合可用培養(yǎng)細胞、新鮮組織、污水細菌、淤泥、糞便，海水、植物等標本，可以對細胞、革蘭氏陽、陰性細菌、環(huán)境細菌樣品進行液體核酸雜交，接下來進行FISH檢測或流式細胞術(shù)檢測、甚至進行流式分選技術(shù)。
通過把FISH技術(shù)與流式聯(lián)合應用，即Flow-FISH，可檢測同時檢測細胞微生物的核酸與抗體。Flow-FISH允許同時測量多個靶點。如亞菌株的分析或鑒定，用于哺乳動物細胞與不同的微生物作用機制。如研究細胞內(nèi)病原體-病毒、細菌群、真菌群的發(fā)病機理，相互作用，如EB、HIV-1、新冠病毒如何在細胞內(nèi)致病等規(guī)律。
（一）試劑：抗熒光衰減試劑(含DAPI)、乙醇（50%，85%，95%、100%，冷存，固定）、FISH固定液、FISH雜交液、細菌培養(yǎng)基、各種標記的核苷酸探針、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（pH 7.4）、20XSSC（0.1X，pH 7.0）。
（二）設(shè)備：鋁箔、蓋玻片、離心機、移液器、吸頭、顯微鏡、熒光顯微鏡（適當濾光片）、透明指甲油或抗熒光封片劑、分光光度計、培養(yǎng)管、微型離心管、水浴鍋或雜交儀。
（三）培養(yǎng)的細胞
1.將細胞接種到培養(yǎng)瓶，在指數(shù)最佳生長時候，進行細胞計數(shù)觀察，將適當細胞密度用于比較雜交�？梢约尤氩《尽⒄婢�、細菌進行相互作用的研究。
2.丟棄上清液，并將細胞用胰蛋白酶消化完全重新懸浮在1 ml的pH 7.4的1X PBS中。
3.以3,000 g離心5 min，丟棄上清液。
4.在500 µl 1X PBS（pH 7.4）中重新懸浮細胞。
5.加500 µl冷100%乙醇，將試管儲存在−20°C。固定細胞可在−20°C下儲存數(shù)月。
6.雜交之前，3000g，5 min使細胞顆�；瘲壣锨逡�，去除殘留乙醇。
（四）革蘭氏陽性細菌固定
1. 細菌培養(yǎng)物，接種2 ml肉湯培養(yǎng)物并在最佳生長溫度、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)后，進行OD600分光光度計讀數(shù)，將適當細胞密度用于比較雜交。
2. 在對數(shù)生長期（OD600=0.4-1.0），以13,000 g離心5 min獲取細菌。在生長的對數(shù)期收集的細胞將提供較好的信號。如果需要，使用較大規(guī)模培養(yǎng)，但小規(guī)模的培養(yǎng)物也能為FISH提供足夠的細胞數(shù)量。
3.丟棄上清液，并將細胞完全重新懸浮在1 ml的pH 7.4的1X PBS中。
4.以13,000 g離心5 min，丟棄上清液。
5.在500 µl 1X PBS（pH 7.4）中重新懸浮細胞。
6.加500 µl冷100%乙醇，將試管儲存在−20°C。固定細胞可在−20°C下儲存數(shù)月。
7.雜交之前，以13,000g，5 min使細胞顆�；瘲壣锨逡骸募毎w粒中去除殘留乙醇。
（五）革蘭氏陰性細菌固定
1.對于每個細菌培養(yǎng)物，接種2 ml肉湯培養(yǎng)物，在培養(yǎng)基中以最佳生長溫度培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)完成后，進行細胞計數(shù)（或OD600分光光度計讀數(shù)），以合適細胞密度用于比較雜交。
2.將每種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到2 ml微型離心管中，以13,000 g離心5 min。丟棄上清液。
3.在每管1 ml FISH用固定液中重新懸浮細胞顆粒，并在室溫下培養(yǎng)3 h。
4.以13,000g離心細胞混合物5 min并丟棄上清液。
5.通過50%乙醇重新懸浮并在室溫下孵育5 min，洗滌細菌。
6.以13,000 g離心試管2 min，丟棄上清液。
7.用80%和95%的乙醇重復步驟12-13。
8.將試管置于真空干燥機中干燥細胞顆粒10 min。固定后可在4°C下儲存1個月。
（六）環(huán)境水樣、空氣、污泥等固定
對于環(huán)境樣品，有必要包括未與標記探針孵育的樣品，以評估樣本的自發(fā)熒光。
1.盡可能使環(huán)境樣品均勻化，減少聚集對獲得探針可接近的單細胞懸浮液的不利影響。在雜交之前通過離心分離細胞或洗滌環(huán)境樣品。
2.不同細菌類別，選擇不同固定方案。環(huán)境樣品很可能含有革蘭氏陰性和陽性細菌的混合物，有必要對革蘭氏陰性和陽性細菌在雜交之前，可用兩次不同方法固定。
（七）預雜交與雜交。
1.將固定細胞重新懸浮在500 µl FISH雜交溶液中，在37°C下培養(yǎng)30 min。完成后移除一份與預雜交混合物的（如50 µl）進行雜交。每個樣品都能進行多次雜交，減少每個反應所需的探針。
2.混合物中加入熒光標記核苷酸探針。
探針濃度應根據(jù)經(jīng)驗決定。幾個因素可影響所需探針數(shù)量：探針靈敏度、樣品密度和雜交時間。根據(jù)經(jīng)驗，將5 µl 100 ng/µl探針加到50 µl預雜交液,中可產(chǎn)生一致且均勻的熒光。
3.在37°C至65°C避光處雜交或用鋁箔覆蓋試管孵育2-3 h。如使用多個探針，建議65℃下進行雜交。根據(jù)經(jīng)驗42°C，改變甲酰胺濃度，可以達到所需的雜交效果。
4.以13,000 g離心混合物5 min并丟棄上清液。
5.通過在20 µl 0.1X SSC中重新懸浮細胞顆粒以清洗細胞，37°C的黑暗中培養(yǎng)15 min。
6.以13,000 g離心混合物5 min并丟棄上清液。
7.重復步驟22-23兩次。
8.在20 µl 0.1X SSC中重新懸浮洗滌過的細胞顆粒。
9.在載玻片上制備樣品：
i. 將10 µl樣品轉(zhuǎn)移到用乙醇清洗過的顯微鏡載玻片上。
iv. 儲存載玻片于黑暗中。在觀察前可在4°C的黑暗中保存至多1 周。
10.通過流式檢測，選擇正確的流式激光的通道。
（七）實驗問題：
1. 雜交溫度：更低的溫度會導致探針雜交增加，但也會降低特異性。
2.去離子甲酰胺濃度：可能需要低濃度的甲酰胺。一般情況下，0%-40%的甲酰胺尋找合適的范圍濃度。
3.探針設(shè)計和濃度：探針設(shè)計自行設(shè)計標記或者聯(lián)系我們，摩爾濃度0.5-5μM比較恰當，可能需要探針標記方法和探針的長度進行調(diào)整，長片段的探針可以稀釋，短的濃度高一些。
4.洗滌步驟中使用的SSC濃度：使用1X SSC代替0.1X SSC將降低洗滌步驟的嚴密性。
5.洗滌溫度：37°C通常被認為是最佳洗滌溫度，5°C為增量或降低溫度調(diào)整洗滌條件。
6.洗滌步驟的次數(shù)：減少洗滌步驟的次數(shù)會降低雜交的嚴密性。不建議少于兩次的洗滌。
7.雜交混合物或制備的載玻片的儲存條件：如果雜交混合物或制備的載玻片未在黑暗中儲存或觀察前的儲存時間超過了建議的時長，則可能發(fā)生熒光降解。
8.探針沒有與所需的細菌細胞特異性雜交。上述降低雜交嚴密性的因素可以調(diào)整，用嚴密的雜交反應。增加雜交和洗滌溫度及洗滌步驟次數(shù)，將增加探針雜交的特異性和洗滌的嚴密性。雜交溶液的甲酰胺含量可以增加（不超過40%），調(diào)整，以確定理想雜交條件。
9.熒光信號過大或有光漂白現(xiàn)象。如果觀察到過量熒光或出現(xiàn)光漂白，應考慮以下因素：1）細胞密度：在雜交反應中使用過多的細胞會使視場擁擠，難以觀察到個體細胞。2）制備的載玻片的存放：制備好的載玻片應立即存放暗處，在觀察中盡快拍圖。
10.流式FISH的最大問題之一在于流式分析的設(shè)門，要考慮病毒、細胞、真菌的大小。
