細菌原位雜交介紹之三-----不同標本類型的檢測
1.培養(yǎng)后的細菌原位雜交：
（1） 細菌FISH探針的濃度為25-60μg/ml，即大約5-25μM濃度，雜交液稀釋20-50倍。
（2） 將菌株震蕩混合10秒，用鉆石筆在玻璃上畫圈，利用移液槍滴加50μL的細菌，并將載玻片置于37℃或室溫干燥后1-24小時。
（3） 利用梯度乙醇濃度(50%，85%和95%)脫水，每次3分鐘。在100%乙醇中脫水后，將載玻片風干，約1-60分鐘。
（4） 雜交液稀釋細菌探針（1:50）。取50μL探針溶液加在玻片上，加玻片，多出溶液用紙巾擦拭。放入孵育盒，然后蓋好密封蓋，避光48°C中雜交5小時或37℃過夜。
（5） 配置洗滌緩沖液(700mM NaCl 72 mL, 17mM Tris/HCl，0.1% SDS)，在46°C或37℃的水浴中浸泡30分鐘。
（6） 再利用純水浸泡10分鐘，去除多余的鹽分。每片加50μL 抗熒光淬滅劑DAPI，室溫避光靜置20分鐘。熒光顯微鏡下，觀察結果，拍照。
2.新鮮組織的細菌原位雜交：
（1） 取材新鮮活體組織，使用卡氏固定液，固定3-12小時。石蠟包埋，切片5-8μM。
（2） 二甲苯中浸泡2次，10分鐘每次，在梯度乙醇50%，80%和95%中，按順序脫水，每次3分鐘，晾干標本，約1-2小時。
（3） 將雜交液與探針按照25:1稀釋細菌探針。取50μL探針溶液加在玻片上，加玻片，紙巾擦拭干凈。放入保濕孵育盒，封蓋，避光48°C中雜交5小時，或37℃過夜。
備注：如果是陳舊標本需要使用細菌原位雜交試劑進行處理，如需要，請聯(lián)系我們。
（4） 洗滌緩沖液(700mM NaCl 72 mL, 17mM Tris/HCl，0.1% SDS)，在46°C或37℃的水浴中浸泡30分鐘。
（5） 再利用純水浸泡10分鐘，去除多余的鹽分。每片加50μL 抗熒光淬滅劑DAPI，室溫避光靜置20分鐘。觀察結果。
（6） 在40倍或60倍或100倍熒光顯微鏡下觀察，拍照。
3.血清和嘔吐物的細菌原位雜交：
（7） 細菌FISH探針的濃度為25-60μg/ml，即大約5-25μM濃度，雜交液稀釋20-50倍。
（8） 將血清或嘔吐物，混合10秒，12000rpm，離心1分鐘，用鉆石筆在玻璃上畫圈，利用移液槍滴加20-50μL的細菌，將載玻片置于56℃30min，或室溫干燥1-24小時。
（9） 滴加梯度乙醇濃度(50%，85%和95%)脫水，每次1分鐘。將載玻片風干，約20分鐘。
（10） 雜交液稀釋細菌探針（1:50）。取50μL探針滴液加到玻片，蓋玻片覆蓋，多出溶液用紙巾擦拭。放入孵育盒，然后蓋好密封蓋，避光56°C中雜交2小時或37℃過夜。
（11） 配置洗滌緩沖液(700mM NaCl 72 mL, 17mM Tris/HCl，0.1% SDS)，在46°C或37℃的水浴中浸泡10-30分鐘。
（12） 再利用純水浸泡10分鐘，用手甩干。每片加50μL 抗熒光淬滅劑DAPI，室溫避光靜置20分鐘。熒光顯微鏡下，觀察結果，拍照。
4.流式細胞與核酸雜交技術結合----細菌檢測
外顯子生物專業(yè)提供熒光原位雜交探針多年，探針涵蓋DNA、mRNA、miRNA、cicrRNA、LncRNA、nascent RNA、piRNA、細菌、真菌、寄生蟲等原位雜交探針以及配套試劑盒和配套原位雜交檢測設備。熟練應用各種核酸探針標記方法。
流式細胞術應用廣泛，我們利用流式細胞術與FISH技術結合，對培養(yǎng)的細菌、血液微生物，血液培養(yǎng)、痰液、肺泡灌洗液、污染的食品痰進行探針雜交，然后進行流式分析，發(fā)現(xiàn)探針雜交后細菌能很好地應用于流式分析和分選出目的細菌，可以在感染血液、痰液等樣品中快速檢測和識別感染的種水平的微生物。與常規(guī)實驗室方法PCR、測序、培養(yǎng)等技術。流式-FISH結合的方法，快速檢測特定的細菌，初步試驗還表明可以對細菌進行分選，檢測常見感染10多種微生物，如肺炎克雷伯氏菌屬肺炎克雷伯菌，鏈球菌、金黃色葡萄球菌，致病大腸桿菌等等，甚至還有一些真菌和部分寄生蟲。
流式細胞技術應用于原位雜交，對標本處理要求不同，不需要用福爾馬林固定，對標本是當處理，適合用于快速鑒別在各種肺部感染、敗血癥患者、腸道感染微生物檢測，能達到屬或種的水平檢測。
流式細胞檢測細菌實驗步驟
（1） 血清、污水、嘔吐物、牛奶等液體，適當?shù)娜芤禾幚恚?/span>8000rpm，離心1分鐘；
（2） 吸取上清20μL，加入配置好的核酸探針，85℃加熱樣品5分鐘，60℃孵育30分鐘；
（3） 流式細胞儀上機檢測，流式務必做好對照。包括只含空白探針對照、單純待檢測樣品對照、待檢測樣品對照。
（4） 結果分析，設門的時候需要，顆粒大小參考對照，熒光變化參考對照。
如果遇到更多問題，請聯(lián)系我們。我們提供探針、試劑盒、耗材、設備等等。
聯(lián)系電話：020-89895006 180 1199 7127 (24小時) E mail：focobio@126.com
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