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培養(yǎng)細胞中期染色體制備
作者: 發(fā)布于:2014/3/14 11:34:51 點擊量:
1. 試劑的準備
(1) 10μg/ml 秋水仙素;
(2)0.075M 低滲液: 2.795 KCl + 500ml 蒸餾水
(3) 固定液 ——甲醇:冰醋酸=3:1(該試劑必需現(xiàn)配現(xiàn)用)
2. 實驗方法
(1) 當細胞系的融合達到約75-90%時,于每5ml 的培養(yǎng)基細胞中加入25-50μl 秋水仙素,繼續(xù)培養(yǎng)30min 至2 h(培養(yǎng)時間決定于細胞的生長速度及不同種細胞系間的差異);
(2) 按照常規(guī)的方法用胰蛋白酶進行細胞的消化;
(3) 將低滲液于37℃水浴中預熱;
(4)低滲:加入10ml 0.075MKCl 溶液,用力吹打散開,吹打100 次,37℃水浴低滲15 分鐘。
(5)預固定:加1.5ml固定液并用吸管輕輕吹勻,進行預固定10分鐘。
(6)離心:2000rpm 離心5 分鐘,棄上清液。
(7)固定I:沿管壁慢慢加入固定液6ml,用吸管吹打成細胞懸液后,37℃水浴20 分鐘。
(8)離心:1000rpm 離心10 分鐘,棄上清液。
(9)固定II:同固定I。
(10)離心同步驟9,離心去上清后,、加0.3-0.5ml 固定液,吸管吹打成細胞懸液。

(11)滴片:用吸管取細胞懸液,高度30-40 cm,滴在預冷的載玻片上,室溫晾干,然后90℃烤箱烤片0.5 小時。




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