凝膠遷移試劑盒（EMSA Kit）
貨號：R5130 規(guī)格：50T
本試劑盒室溫運輸，4℃儲存。
試劑盒介紹：
電泳遷移率遷移分析，簡稱為“凝膠遷移”“EMSA”，生物素標(biāo)記的DNA片段將含有特定DNA位點與DNA結(jié)合蛋白一起孵育。蛋白質(zhì)DNA 通過非變性電泳將復(fù)合物與游離DNA分離，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質(zhì)阻礙了結(jié)合的DNA片段的遷移。從而導(dǎo)致游離的DNA比DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物遷移更快。凝膠結(jié)果揭示游離和結(jié)合的生物素標(biāo)記DNA的位置。
試劑盒成份：
1、Bovine serum albumin (BSA; 50μg/μL,5%)
2、Buffer A
3、DNA loading buffer（bromophenol blue）
5、DTT; 0.1 M
6、0.5× TBE and 1% glycerol
7、Glycerol (20% v/v)
8、MgCl2 (0.1 M)
9、Poly(dI-dC) (1 μg/μL)
10、TBE buffer (5×)
自行準(zhǔn)備如下試劑：
1、 TEMED
2、 Gel-fixing solution (20% methanol and 10% acetic acid)
3、 Acrylamide mix (30%;acrylamide:bisacrylamide, 29:1)
4、 Ammonium persulfate (10%)
5、 Binding protein (0.5–100 ng/μL)
6、 親和素-HRP
簡略步驟
1. 準(zhǔn)備40 mL的4.5％丙烯酰胺凝膠。
丙烯酰胺混合物6.0 ml；
TBE緩沖液（5×）4 mL；
甘油（20％）2ml；
H2O 28ml；
過硫酸銨（10％）300μL。
2. 在倒入之前，添加30μL TEMED，搖動均勻。
3. 倒入凝膠。
4. 在10 mA下將凝膠預(yù)電泳2小時。
5. 在0.5 mL微量離心管中加入：
*EMSA結(jié)合Buffer20μL；（可直接購EMSA 5X buffer）
1）重組蛋白（0.5–100 ng /μL）2.00μL；
2）生物素標(biāo)記的DNA（1 fmol /μL）2.00μL；
3）聚dI-dC（1μg/μL）0.40μL；
4）牛血清白蛋白（50μg/μL）0.50μL；
5）DTT（0.1 M）0.20μL；
6）氯化鎂（0.1 M）1.50μL
7）緩沖液D 13.40μL
備注：上述樣品可以等體積擴大。
6. 將樣品在30°C下孵育1小時或在室溫2小時。
7. 非常小心地將樣品直接加樣（即不添加染料）到樣品池孔的底部。10mA條件，啟動電源4.5％天然聚丙烯酰胺凝膠。加入少量（例如5μL）的DNA上樣緩沖液。
8. 溴酚藍大約在凝膠的三分之二處遷移。通常運行4-6小時就足夠了，取決于DNA片段的大小。
9. 凝膠電泳完成后，小心除去緩沖液。取出凝膠。拆下墊片并分離板，保持凝膠附著在一塊板上。
10. 將凝膠浸泡在親和素-HRP溶液（1:500稀釋）中，可用塑料袋。在凝膠固定溶液中固定15分鐘。
11. 將凝膠放在兩張吸水紙上。用保鮮膜覆蓋凝膠的頂部，在凝膠干燥器上于70°C放置1小時。
12. 將干燥的凝膠暴露在HRP顯影液中，曝光顯影。
原因排除
問題：沒有綁定條帶。
解決：通常表明該蛋白質(zhì)未濃縮或未結(jié)合該位點，或緩沖液條件與電泳過程中的蛋白質(zhì)結(jié)合不兼容。嘗試更大蛋白質(zhì)濃度，改變緩沖液pH和鹽濃度，替代電泳運行緩沖液，或在較冷的房間中于4°C運行凝膠。
問題：條帶過多。
解決：額外的條帶通常是由非特異性結(jié)合引起的。嘗試添加更少的蛋白質(zhì)而更多DNA探針。
問題：凝膠不干凈。
解決：表明電泳過程中蛋白質(zhì)解離，而電泳中蛋白質(zhì)過多。反應(yīng)或在太高的溫度下電泳凝膠。電泳更多的凝膠慢慢地，降低蛋白質(zhì)濃度，嘗試在冷室中運行凝膠，改變緩沖液條件，或添加更多競爭者DNA。
EMSA相關(guān)試劑：
EMSA/Gel-Shift 結(jié)合5XBuffer
貨號：R5130-1
儲存：-20℃
體積：300μl
EMSA/Gel-Shift 結(jié)合緩沖液(5X) buffer 成份
10×binding buffer
Poly(dI.dC)
魚鮭精DNA
50% 甘油
100uM MgCl2
10% NP-40
使用步驟：
見本公司EMSA試劑盒說明書，同其他廠家試劑盒通用。
EMSA loading buffer (10X)
貨號：R5130-2
儲存：-20℃
體積：1 ml
EMSA Loading buffer 成份，
Ficol 400等
未添加苯青和溴酚藍指示劑
使用步驟：
見本公司EMSA試劑盒說明書，同其他廠家試劑盒通用。
EMSA loading buffer (10X，含染料)
貨號：R5130-3
儲存：-20℃
體積：1 ml
EMSA Loading buffer 成份，
Ficol 400等
添加苯青和溴酚藍指示劑
使用步驟：
見本公司EMSA試劑盒說明書，同其他廠家試劑盒通用。
Poly(dI-dC) (1 μg/μL)
貨號：R5130-4
儲存：-20℃
體積：100μl
EMSA 生物素結(jié)合探針（訂制）
貨號：R5130-X
儲存：-20℃
體積：500μl
TBE buffer 5X
貨號：R5130-5
儲存：-24℃
體積：100ml
50% 甘油 滅菌
貨號：R5130-6
儲存：-24℃
體積：10ml
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